通用名稱：柯薩奇病毒16型病毒RNA檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）
英文名稱：Diagnostic Kit for Coxsachie Virus 16（CA16）viral RNA（Fluorescence PCR）

【檢驗(yàn)方法】
1. 核酸分離：
取200μl咽試子（肛拭子）樣本進(jìn)行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 （硅膠膜吸附法），該試劑盒可用于對(duì)腸道病毒樣本中的病毒RNA提取，并按試劑盒說明書要求操作。
本品中的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均參與核酸提取。
2. PCR擴(kuò)增：
2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
2.1.1待檢樣本檢測(cè)：每份樣本使用CA16反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)CA16反應(yīng)液的檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣本進(jìn)行判定。
2.1.2對(duì)照品檢測(cè)：每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
2.2反應(yīng)體系的配制：
2.2.1準(zhǔn)備工作：將CA16反應(yīng)液融化后振蕩混勻，離心6000rpm 10秒。
2.2.2 反應(yīng)體系配制：取1個(gè)1.5ml 無核酸酶離心管，計(jì)算待測(cè)樣本數(shù)量（n），取20μl×（n+2）CA16反應(yīng)液、1μl×（n+2）DNA聚合酶和0.35μl×（n+2）逆轉(zhuǎn)錄酶充分混勻，離心6000rpm 10秒。
n+2=n份樣本+1份陽(yáng)性對(duì)照+1份陰性對(duì)照;
2.3反應(yīng)體系分管：
每份待測(cè)樣本設(shè)置1個(gè)PCR擴(kuò)增管，分別將每種反應(yīng)體系按20μl/管分裝至對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增管中。
2.4加樣：
取5μl（待測(cè)樣本RNA、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）分別加入1個(gè)PCR擴(kuò)增管。
2.5擴(kuò)增檢測(cè)：
將加樣后的PCR擴(kuò)增管分別轉(zhuǎn)移到全自動(dòng)熒光定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，不同儀器的設(shè)置如下：
2.5.1全自動(dòng)熒光定量PCR檢測(cè)儀（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）擴(kuò)增程序：
對(duì)于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動(dòng)熒光定量PCR檢測(cè)儀，熒光信號(hào)設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型號(hào)儀器可設(shè)置為FAM通道（僅收集FAM熒光信號(hào)）。熒光PCR擴(kuò)增程序的設(shè)置見表1。反應(yīng)總體積為25μl。
其他詳見說明書...

3. 結(jié)果分析：
3.1本品熒光探針的報(bào)告熒光為FAM，應(yīng)選擇F1（Fam）通道分析試驗(yàn)結(jié)果。
3.2 基線（Baseline）范圍根據(jù)儀器要求設(shè)定，目的為校正背景熒光干擾，終止循環(huán)（END）一般設(shè)置為強(qiáng)樣本出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的前3-4個(gè)循環(huán)。
3.3 閾值線用于判斷樣本是否擴(kuò)增，應(yīng)調(diào)整使閾值線高于熒光背景和陰性對(duì)照的熒光信號(hào)，或點(diǎn)擊分析（Analysis）自動(dòng)獲得。
4. 質(zhì)量控制：
每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，且應(yīng)符合以下要求，否則試驗(yàn)結(jié)果不成立。
4.1陰性對(duì)照無Ct值或Ct值為0。
4.2 陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于30.0。
【參考值（參考范圍）】
Ct值≤37.0報(bào)告該反應(yīng)陽(yáng)性；無Ct值或Ct值為0報(bào)告該反應(yīng)陰性；
37.0＜Ct值＜40.0為灰區(qū)。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
結(jié)果在灰區(qū)的樣本需重復(fù)試驗(yàn)：取400μl樣本重新提取RNA（核酸分離試劑盒中裂解液、助沉劑、無水乙醇的用量加倍，其他組分的用量不變）并檢測(cè)。復(fù)檢結(jié)果Ct＜40.0的樣本為陽(yáng)性，否則為陰性。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
本試劑盒檢測(cè)的靶序列為腸道病毒CA16型病毒基因，該靶基因在各毒株間都是高度保守且很穩(wěn)定。但如果在靶序列處發(fā)生基因突變，則有可能造成假陰性結(jié)果，即發(fā)生漏檢。

【包裝規(guī)格】48人份/盒
【儲(chǔ)存條件及有效期】-20℃冷凍保存，有效期暫定6個(gè)月，陽(yáng)性對(duì)照反復(fù)凍融次數(shù)不得超過5次。
【適用儀器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動(dòng)熒光PCR檢測(cè)儀。
【樣本要求】1. 樣本類型：咽試子、肛試子。